مقالات شیلات

خلاصه:

ویروس سندرم لکه سفید مهمترین و جدی ترین عامل بیماری در میگو  در میان ابزیان است . با استفاده ا ز تکنیک PCR مبنی بر روش تشخیصی  که در پی ان  این پرسش مطرح است که ایا  با شیوع   ویروس سندرم   میتواند  در مناطق اطراف  آن  نیزادامه پیدا کند  . از دو  برکه پرورش  میگو و حوضچه های اطراف آن نمونه هایی  گرفته شد. در منطقه ساحلی در شمال ویتنام ایالت   Quang Ninh جایی که پرورش میگوا نجام  میگرفت در دو تا لاب  و در ماه اوریل سال 2001 بخاطر ویروس سندرم لکه سفید   کشته شده اند و  درپی آن تالابها متروک شدند. در مجموع 480  نمونه اب دریا( 30 نمونه در جولای و دسامبر در سال 2001 و 2002 از نظر ویروس سندرم لکه سفید  و تعیین ژن و کروموزوم های موجود در آنها مورد مطالعه قرار گرفتند. اگرچه تعیین میزان کروموزوم های سلول های جنسی این بیماری رفته رفته کاهش پیدا میکند در محیطهای  دریا هم  بیماری میگوهای تالاب  و هم در حوضچه های اطراف , ویروس سندرم لکه سفید با بیش از 10%  این بیماری       در کانالهای  پایین تر در ماه  سپتامبر 2002  یعنی در حدود 20 ماه پس از شیوع  این بیماری  شناسایی شد

کلمات کلیدی: نظارت بر محیط زیست- دریای Quang- میگو- ویتنام- ویروس سندرم لکه سفید

 مقدمه

ویروس سندرم لکه سفید  شامل دو رشته بزرگ از DNA است   , ویروس  سندرم     لکه سفید  مهمترین و جدی ترین بیماری در میان  میگوها در ابزیان است( چن و همکارانش در سال 1997 و چو و همکارانش در سال 1995 و لو و همکارانش در سال 1996). واگیری ویروس سندرم لکه سفید بسیار بالاست  که باعث نابودی کامل میشود بطوریکه شیوع بیماری  در کشورهای  اسیا وا مریکا  3 تا 7 روز پس از عفونت است.( مامویاما و همکارانش در سال 1994, هائو و همکارانش در سال 1999). محیط دریایی نیز تهدید ی برای ویروس سندرم لکه سفید  میزبان برای خرچنگها ی دریایی   و میگو و ماهی ها است(لو و همکارانش         در سال 1996 و فلگل  در سال 1997 و وانگ و همکارانش در سال 1998 و چن و همکارانش در سال 2000  و مائدا و همکارانش در سال 2000 و حامد و همکارانش در سال 2003). انتقال ویروس سندرم سفید  بطور عمودی رخ میدهد در ابزی پروری از لاروهای  الوده یا بصورت افقی از طریق اب یا حیوانات آلوده میتواند  توسط میگوهای ادم خوار رو به مرگ( اوما و همکارانش در سال 2005 , چانگ و همکارانش در سال 1996). مطالعات تجربی ارائه شده  اولین نقش  جانوران ریز شناور در سطح دریا مانند کرم پلی چاییت( وی جایان و همکارانش  در سال 2005 ) رتیفرها و تخمگذاران( یان و همکارانش  در سال 2004) تا جاییکه ممکن است مسیر و  مخزن آب برای ازمایش ویروس  سندرم لکه سفید در حوضچه میگو  حوضچه های اطراف آن است .  استراحت در تخم رتیفرها از راه آزمایش  زمستان را در مخزن استراحت میکنند. میگو   در حوضچه ها و در یا های اطراف  است. استراحت رتیفر در تخم بطور تجربی ثابت کرده بود که مخزن  برای ویروس سندرم لکه سفید  در زمستان ذر محیط دریا سپری میشود( یان و همکارانش در سال 2004).      در حال حاضر مطالعه ما پیرامون ویروس سندرم لکه سفید در  نظارت برمحیط دریا این سوال است که ایا این ویروس  بر حوضچه ها و   مناطق اطراف آن پس از شیوع بیماری ادامه دارد

مواد و روش

نمونه برداری آب دریا

نمونه گیری از سطح اب دریا یکی از حوضچه هایی که در ان میگوهای بیمار وجوددارد  و دیگری کاالهایی اطراف آن است که از انها جمع اوری میشود در دو نوبت یکی در اول ژوئیه ( تابستان)  و دیگری در دسامبر( زمستان)      در سالهای 2001 و 2002 توسط  نمونه برداری های جداگانه سترون میشوند. همه موارد قابل مشاهده بر روی آب شناور میشوند توسط جمع کنندها جداسازی شده و ضدعفونی میشود. میکرب میگو در این دو حوضچه از نظر ویروس سندرم لکه سفید در آوریل 2001 بررسی شد  که همه مردند  با توجه به  بافتها بر اساس آزمون PCR مورد بررسی قرار گرفت و تایید شد و پس از آن از برکه رها شدند. برکه هایی که پرورش  میگو انجام میشود  در نزدیکی ساحل دریا  واقع شده  اند اما هیچ ارتباط مستقیمی با دریا ندارد. هر نمونه اب حداقل یک متر  جدا از سطح اب  کانالها/ تالاب ها بوده است. دو محل نمونه گیری شده باید در حدود 20 کیلومتر از هم فاصله داشته باشند که در منطقه ساحلی ایالت Quang Ninh در ویتنام شمالی  است آب جداشده برای نمونه در بطری های پلاستیکی استریل ریخته شده  و محکم بسته میشود و سپس برای  تچریه و تحلیل به مدت دو ساعت به ازمایشگاه برده میشود

استخراج DNA

  ما از آب تمیز برای تجزیه و تحلیل مولکول DNA در آزمایشگاه زیستی ( ازمایشگاه شرکت سولانا  در ساحل کالیفرنیا) برای تجزیه و تحلیل  DNA در هر نمونه که توسط محصول سازنده ارائه مییشود. بطور خلاصه 30 میلی لیتر اب دریا در هر نمونه  از طریق  تجزیه و تحلیل  غشاء  سپس تجزیه و تحلیل میکرو ارگانیسم های موجود و در نهایت  کل مقدار DNA رها شده و میزان ته نشینی 70% اتونل میشود. DNA خشک شده با میانگیر تلوریوم  غلظت 25 نانو گرم در هر میلی لیتر محلول بوده است

شناسایی ژنوم ویروس سندرم لکه سفید

ژنوم ویروس سندرم لکه سفید در هر یک از 480 نمونه اب توسط روش PCR  تکنیکی که بوسیله کیتپتومچی و همکارانش پیشنهاد  شده است مورد بررسی قرار میگیرد( در سال 2001)

ما این روش را بدلیل حساس  و قدرتنمد بودن  برای شناسایی  ویروس سندرم لکه سفید انتخاب کردیم و میتواند  در نونه به اندازه  5 فموتوگرام  ویروس سندرم لکه سفید DNA را کشف کند (20 ذرات ویروسی) (کیاتپتومچای و همکارانش در سال 2001-سانچز- مارتینز و همکارانش در سال 2007). همانگونه که کیاتپومچای و همکارانش در سال 2001 توصیف کردند تمام شرایط در PCR یکسان بودند. تقویت  ژن  با استفاده از سیستم PCR , 2400 و 9700 است( کاربرد بیو سیستم شهر فوستر) و سپس نگهداری در 4 درجه سانتیگراد. محصولات PCR  توسط الکل اتلیک تصفیه  و الکترو فورز در ژل آگارز 0.8% برای  غلظت DNA تقویت میشود. خالص سازی 250 پتا بایت در ابعاد الکترو فورز از محصول PCR علامتی برای وجود بیماری  ویروس سندرم لکه سفید در  نمونه است. کیاتپاتومچای و همکارانش 3  باند در اندازه های 250, 1.100.256 را گزارش کردند که بستگی به شدت عفونت دارد با اینحال ما در آزمایشها مشاهده میکنیم 250باند را که  در تمام نمونه  ها مشاهده شده است. بنابراین  بعنوان نمونه اگر ویروس سندرم لکه سفید مثبت  باشد  تعداد ژنومهای انتخاب شده  محصولات PCR مثبت و بطور مستقیم  تعیین توالی تایید میشود. واکنش های ترتیب گذاری بطور مستقیم بر روی واکنش PCR  با استفاده نابود گر ترتیب  چرخه ترتیب گذاری در کوادریوم ثانیه  آماده واکنش  کیت( کاربرد نظام زیستی). الگوی DNA(50 نانوگرام) در مورد  واکنش توالی متشکل ازپیش گرمایش برای 2 دقیقه در  96 درجه سانتیگراد و 25  دوره از تقلیب در 90 درجه سانتیگراد برای 30 ثانیه و تنش زدایی آهسته  در 50 درجه سانتیگراد برای 30 ثانیه و امتداد در 60   درجه سانتیگراد برای 4 دقیقه است. محصولات برچسب دار توسط  الکل اتیلیتیک تصفیه شده اند و بعدا یک رابطه کاربردی منشوری با   ABI PRISM توسط 310  تحلیلگر ژنتیکی بوجود آمد( کاربرد  نظام زیستی)

نتیجه و بحث

DNA بطور کلی از 480 نمونه جمع اوری شده از اب دریا که بطور تصادفی انتخاب شده در 4 نوبت  تابستان و زمستان سال 2001 و 2002 در 2 حوضچه و 2 کانال استخراج شد( 30 درصد این نمونه ها در کانال یا تالاب بود) در هر نمونه از DNA   سپس بطور جداگانه ویروس سندرم  لکه سفید  در ژنها تشخیص داده میشود. بررسی تشخیص ژنوم ویروس سندرم لکه سفید در هریک از حوضچه ها و کانالها در شکل 1 نشان داده شده است. در ژوئیه 2001   درست سه ماه پس از شیوع بیماری ویروس سندرم لکه سفید حداقل 90% از آب جمع اوری شده در برکه ها  در کانال اول و دوم بترتیب 36.67 و 46.67 تشخیص داده شدند. همه میگوهای پرورش یافته در 2 تالاب در اپریل 2001 مرده بودند برخی از حوضچه ها بوسیله  دست برداشته شدند  و بسیاری باقی ماندند در ت الاب ها و بتدریج تجزیه شدند . ویروس سندرم لکه سفید  ممکن است در تجزیه میگوی مرده و  موجودارت ریز در سطح دریا و انتقال ان به محیط های اطراف از طریق حرکت آب, فعالیت های انسانها و ادم خواری میگوی مرده( سانچز و همکارانش در سال 2007).  احتمال نسبت 7% و 10% از نمونه های اب در حوضچه های اول و دوم بترتیب دارای ویروس سندرم لکه سفید  منفی بودند  و به   دلیل توزیغ غیر تصادفی از جانوران ریز  الوده  در سطح آب حوضچه  بودند. عمدتا در دسامبر 2001 میزان قابل توجهی از 2 حوضچه و کانال بیش از 45% و 15% از نمونه های اب  آنها کاهش یافت و هنوز هم  در انها ویروس سندرم لکه سفید  مثبت بود. کاهش جمع اوری موجودات زنده در دریا در فصل زمستان  میزان تشخیص  ویروس را کاشه میدهد    و با اینحال ممکن است ویروس باقی مانده شود  و در مرحله ایکه  موجودات ریز روی سطح دریا در خواب هستند شبیه استراحت در تخم  هستند یا لاروها درون رسوبات اب  هستند. بویژه ژنوم ویروس هنوز در تابستان و زمستان سال بعد یعنی  2002 در همان حوضچه     و کانال یافت شد. در ژوئیه کاهش میزان در دو  حوضچه و  دو  کانال  نه در یک کانال  وجودداشت. در دسامبر میزان شیوع ویروس سندرم لکه سفید  بمیزان قابل توجهی کاهش یافته بود اما این ویروس هنوز در اب دریا وجودداشت مخصوصا در دو حوضچه به میزان بیشتر از 10% وجودداشت. این ویروس در زمستان 2002 در ابعاد کوچک در نمونه اب دو کانال شناسایی شد. گزارشات در طول دوره مطالعه در مناطقی که شیوع بیماری رواج دارد هیچگونه تبادلی  مستقیمی در دو حوضچه و کانال  وجود نداشت یا منابع دیگر انسان و حیوان بندرت در حوضچه  و کانال  و جودداشت  و تقریبا همانگونه راکد رها شده بودند.

بطور خلاصه اگرچه  میزان ژنوم ویروس سندورم لکه سفید بطور قابل توجهی  در طول زمان کاهش یافته بود این ویروس در  محیط دریا حداقل یک سال پس از شیوع ادامه داشت. ما بطور مستقیم  تعیین تو الی 20 نوع از محصولات PCR که دارای ویروس سندرم لکه سفید شامل سه نمونه که از کانالهای 1 و 2  در دسامبر 2002 جمع اوری شده بودند در انها تنها یکی یا دو  نمونه PCR مثبت کشف شده است. تمام این محصولاتPCR به 250  قسمت تقسیم شند که DNA ژنومم ویروس سندرم لکه سفید توسط  کیاتپاتومچای گزارش شده بود ( 2001).

آن بایستی اذعان کرد که ویروس سندورم لکه سفید  تا محدوده بسیاری میزبان خرچنگ و پرتارها  را که در محیط ابزی قرارا دارند  به این معنا نیست که  در اب دریا جان سالم به در میبرند حتی زمانی که هیچ میگویی در اطراف وجود ندارد  ادامه دارد. در نتیجه گیری پژوهش مشخص است که ژنوم ویروس  یطور بالقوه در محیط زیست تداوم دارد  برای مدت طولانی بعنوان حداقل یکسال پس از شیوع ویروس سندرم لکه سفید در حوضچه هایی که میگو پرورش میدهند.

تقدیر نامه: با تشکر از کارکنان کشاورزی و ابزی در ایالت Quang Ninh  در ویتنام و تشکر برای کمک  و همکاری. همچنین تشکر از دانشگاه اوزاکا در زاپن بر ای انتقاد  و بازبینی در نسخه های اولیه ما . تشکر از بخش میکروبیولوژی دانشگاه ملی هانوی در ویتنام و همچنین تشکر از صاحبان  برکه  میگو و تشکر از دکتر والت لیتمن برای ویرایش انگلیسی با تشکر از    دو  تجد یدنظر کننده بدون نام  که نظزات و انتقادات و پیشنهادات خود در  این مقاله ارائه دادند