مقالات شیلات

         مارکرهاي مولکولي

امروزه از مارکرهاي مولکولي و به ويژه مارکرهاي مبتني بر DNA به طور گسترده اي در بسياري زمينه ها از قبيل نقشه يابي و رديابي ژن ها، تعيين جنسيت، بررسي تنوع ژنتيکي يا روابط ژنتيکي به کار مي روند. در ژنتيک جمعيت مارکهاي مبتني بر پروتئين (آلوزايم ها) اولين مارکرهايي بودند که به طور گسترده مورد استفاده قرار گرفتند. روشهاي مبتني بر DNA امروزه بهترين روش هايي هستند که براي تمايز بين موجودات بسيار نزديک به هم انتخاب مي شوند. استفاده از مارکر هاي مبتني بر DNA حتي امکان مقايسه هاي کارآمدي را نيز فراهم مي نمايد.

1- 1 تعريف ها

بر اساس تعريفي که استنزفلد در 1986 ارايه داد، واژه مارکر معمولاً براي مارکر لوکاس به کار مي رود. هر ژني جايي در طول کروموزوم به نام لوکاس دارد. ژن ها مي توانند از طريق جهش به چندين شکل متفاوت تبديل شوند که آلل (يا شکل هاي آللي) ناميده مي شوند. تمامي شکل هاي آللي يک ژن در يک جايگاه در کروموزوم هاي هومولوگ قرار مي گيرند. هنگامي که شکلهاي آللي يک لوکاس يکسان باشند، گفته مي شود که ژنوتيپ، هوموزايگوت (در اين لوکاس) است، در حالي که شکلهاي آللي متفاوت، هتروزايگوت را ايجاد مي نمايند. در موجودات ديپلوييد، ژنوتايپ با دو شکل آللي کروموزوم هاي هومولوگ ايجاد مي گردد. بنابراين مارکرهاي مولکولي عبارتند از تمامي مارکرهاي لوکاس هاي مربوط به DNA (مارکرها ميتوانند بيوشيمايي يا مورفولوژيک نيز باشند).

1-2  مارکر مولکولي مناسب براي ژنتيک جمعيت کدام است؟

يک مارکر مولکولي مناسب بايد:

1-1.         توارث مندلي داشته باشد: يعني از نسلي به نسل ديگر منتقل شود.

1-2.           پلي مورفيک باشد: يعني آلل هاي متعددي را در لوکاس مورد بررسي نشان دهد.

1-3.           هم بارز باشد: يعني بتوان هوموزايگوت و هتروزايگوت را از هم تشخيص داد.

1-4.           خنثي باشد: يعني همه آلل ها شايستگي يکساني داشته باشند.

1-5.           اپيستازي نداشته باشد: يعني بتوان بدون توجه به ساير لوکاسها ژنوتيپ هر فنوتيپي را تعيين نمود.

1-6.            مستقل از محيط باشد: يعني فنوتايپ از محيط تأثيري نپذيرد.

1-7.           در طول ژنوم زياد تکرار شود.

1-8.           تکرارپذيري بالايي داشته باشد.

مارکرهاي پرکاربرد در ژنتيک جمعيت عبارتند از: آلوزايم ها، RAPD، RFLP، AFLP، انگشت نگاري ميني ستلايت ها، مايکروستلايت ها و SSR.

انتخاب يک مارکر مولکولي به مناسب بودن آن براي پاسخ دادن به يک پرسش اکولوژيک بستگي دارد. بنابراين آنها براي تخمين جريان ژنها بين جمعيت ها مثلاً به منظور بررسي تنوع مناسبترند يا ترجيح داده مي شوند. از طرف ديگر مارکرهاي غالب مي توانند ژنوتيپ را تخمين بزنند اما نمي توانند فراواني هاي آللي را تخمين بزنند. مارکرهاي غالب ترجيحاً براي انگشت نگاري به کار رفته و مي توانند در شناسايي کلون ها مفيد باشند.

براي بررسي تنوع ژنتيکي Cirsium arense از مارکر جديدي به نام AFLP استفاده شد. اين مارکر تمامي ويژگي هاي يک مارکر هاي مولکولي مناسب را غير از همبارز بودن دارد. مارکرهاي AFLP مارکرهاي غالب هستند. با اين حال به علت پلي مورفيسم بالايي که مارکرهاي AFLP تشخيص مي دهند کارآمدترين مارکر هستند. به خصوص در جايي که روابط نزديکي وجود دارد. به علاوه از نگاه تکنيکي هيچ اطلاعاتي از توالي DNA نياز نيست، مارکرهاي زيادي را مي توان در مدت کوتاهي بررسي نموده و تنها مقدار کمي DNA لازم است.

2.     AFLP

پلي مورفيسم طول قطعات تکثير شده تکنيک جديدي در انگشت نگاري DNA است که توسط زابيو و ووس (1993) ابداع شد البته به ووس و همکاران (1995) و ووس و کويپر (1997) نيز مراجعه کنيد. اين روش مبتني بر تکثير قطعات برش يافته انتخابي حاصل از هضم کلي DNA ژنومي با PCR است. محصولات تکثير که قبلاً نشاندار شده اند از طريق الکتروفورز از هم تفکيک مي شوند. طول قطعات DNA حاصل بين 60 تا 500 جفت باز است. براي قابل مشاهده نمودن پلي مورفيسم DNA که معمولاً از قطعات کوچک چند جفت بازي DNA (حداکثر تا 500) تشکيل شده ابتدا اين قطعات بايد تکثير يابند. اين تکثير اغلب از طريق PCR انجام مي گيرد. روش PCR مي تواند قطعات خاصي از DNA را طي آغاز دقيق واکنش پلي مريزاسيون که در دو انتهاي DNA مورد نظر اتفاق مي افتد تکثير يابد. اين آغاز دقيق توسط توالي هاي اليگونوکلئوتيدي کوتاهي (پرايمرها) انجام مي شود که مي تواند DNA الگو را در ناحيه مورد نظر ذوب نمايد. پرايمرها بين 18 تا 24 جفت باز طول داشته و در آزمايشگاه و مطابق توالي DNA مکمل خود که در ناحيه باز شده رشته سنگين DNA مورد نظر سنتز مي شود. PCR ابتدا با يک فاز حرارتي بالا (واسرشت سازي) آغاز مي شود که طي آن DNA تک رشته اي توليد مي شود. آنزيم تک پلي مراز هر يک از رشته هاي DNA دو رشته اي را به صورت نقطه آغازي براي سنتز شناسايي کرده و با رسيدن دما به 72 درجه سانتيگراد واکنش پلمريزاسيون را در جهت  5'  3' ادامه مي دهد (دماي بهينه طويل شدن). بنابر اين براي طراحي پرايمرهاي اختصاصي بايد توالي هاي نواحي بازشدگي DNA مورد نظر را بدانيم. در نتيجه اطلاعات ما درباره ژنوم بيشتر شده و مطالعات بسيار دقيق تري مي توان انجام داد. اين مرحله نياز به تجهيزات کامل آزمايشگاهي داشته و اغلب بسيار وقت گير است. اساس روش AFLP طراحي و سنتز پرايمرهاي اختياري و سپس اتصال آنها به قطعاتDNA  هدف است. پرايمرهاي اختياري AFLP آداپتور ناميده شده و از تواليهاي 20 نوکلئوتيدي شناخته شده اي تشکيل شده اند. توالي هاي DNA هدف، قطعات DNA حاصل از آنزيم هاي برشي هستند. اين قطعات از هضم کلي DNA ژنومي از اثر ترکيبي دو آنزيم برشي ايجاد مي گردند. سپس آداپتورها با کمک آنزيم ليگاز به دو سر قطعات برش يافته متصل مي شوند. سرانجام طي يک مرحله PCR آداپتورها به عنوان جايگاه هاي آغاز تکثير قطعات برش يافته به کار مي روند. مارکرهاي AFLPپلي مورفيسم جايگاه برش را آشکار نموده و بايد به عنوان مارکرهاي غالب در نظر گرفته شوند. زيرا نمي توان هوموزايگوت ها و هتروزايگوت ها را از هم تشخيص داد، مگر اين که مطالعات اصلاح نژادي و شجره اي انجام شود تا الگوهاي توارث هر قطعه مشخص شود. اما بسياري از قطعات تخمين هايي از تنوع را در سراسر ژنوم نشان مي دهند. بنابراين نمايي کلي از سطح تنوع ژنتيکي موجود مورد مطالعه را نشان نشان مي دهند.

2-2-  مراحل اصلي انگشت نگاري با AFLP

2-2-1-  استخراج DNA

DNA خالص و با وزن مولکولي بالا براي AFLP ضروري است. در اينجا DNA با روش دايل و دايل استخراج شده است(Doyle and Doyle, 1988). اين روش بر اساس فرآيند CTAB انجام مي شود. براي جزئيات بيشتر به بخش هاي پروتوکل (3-3) و عيب يابي (4-3) مراجعه نماييد.

2-2-2-  هضم با آنزيم هاي برشي

قطعات برش يافته DNA ژنومي با استفاده از دو آنزيم برشي مختلف به دست آمده اند: يک آنزيم برشي فراوان (آنزيم برشي چهار بازي MseI) و يک آنزيم برشي نادر (آنزيم برشي شش بازي EcoRI). آنزيم رايج تر براي ايجاد قطعات کوچک که به خوبي تکثير شده و براي تفکيک روي ژل الکتروفورز مناسب ترند در حالي که آنزيم نادرتر تعداد قطعاتي را که را بايد تکثير شوند محدود مي نمايد.

2-2-3-  اتصال آداپتورهاي اليگونوکلئوتيدي

آداپتورهاي دو رشته اي از يک توالي مرکز و يک توالي اختصاصي براي هر آنزيم تشکيل شده اند. بنابراين آداپتورها براي جايگاه برش هر يک از آنزيم هاي EcoRI و MseI اختصاصي عمل مي کنند. معمولاً مراحل برش آنزيمي و اتصال به آداپتورها در يک مرحله صورت مي گيرد. اتصال آداپتور به DNA برش يافته جايگاه برش را دچار تغيير مي کند تا از برش ثانويه پس از اتصال آداپتورها جلوگيري نمايد. توالي مرکزي آداپتورها از يک توالي شناخته شده 20 نوکلئوتيدي تشکيل شده که بعداً در PCR به عنوان پرايمر به کار مي رود.

2-2-4-  تکثير اوليه

اين مرحله يک PCRمعمولي است که در آن از آداپتورها به عنوان پرايمر استفاده شده است. اين PCR اوليه تکثير اوليه نيز ناميده مي شود که امکان انتخاب اوليه قطعات را از طريق تکثير قطعات برش يافته DNA که به دو انتهاي آن آداپتور متصل است فراهم مي نمايد. علاوه بر توالي هاي آداپتورها، پرايمرهاي به کار رفته براي تکثير اوليه يک باز اضافي هم دارند. اين باز اضافي امکان يک گزينش مضاعف را از طريق تکثير يک چهارم از قطعاتي که يک آداپتور به هر يک از دو سر آن متصل است مقدور مي نمايد. اين سه مرحله (استخراج DNA، هضم آنزيمي / اتصال آداپتورها و تکثير اوليه) را مي توان روي يک ژل آگاروز 6/1% الکتروفورز و قابل مشاهده نمود.

2-2-5-         تکثير انتخابي